多聚甲醛固定细胞一般固定多久(细胞多聚甲醛固定后4℃保存)

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• 1、
• 2、12孔板细胞多聚甲醛固定怎么操作

12孔板细胞多聚甲醛固定怎么操作

1、在培养板中培养好细胞后，吸除培养基，使用PBS轻洗细胞2×3min，做固定（凋亡的TUNEL染色等可以不清洗）。
2、固定：加入4%多聚甲醛(PBS配制)固定20分钟。如暂时不能立即做组化检测，使用含0.4%多聚甲醛的PBSPH7.4浸泡细胞（免疫组化检测完成前不要让细胞变干，否则细胞收缩形态不好）。
3、除去多聚甲醛，使用PBS轻洗细胞3×3min。
4、通透：0.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）。
5、除去TritonX-100，使用PBS轻洗细胞3×3min。
6、内源性过氧化物酶处理：3%H2O2孵育15min（选做，必做二抗连HRP，其他的如做免疫荧光染色不用做）。
7、除去H2O2，使用PBS轻洗细胞3×3min。
8、封闭：用10%的与二抗同源的血清(PBS配制)封闭半小时。封闭结束后不要洗，直接上一抗。
9、一抗：滴加足够量适宜浓度的一抗，4℃孵育过夜（或37℃，60min）；若有两种一抗（要是不同种属的）则同时孵育，两种二抗亦同时孵育（二抗同时使用时最好是同一种属）。
10、除去一抗，使用PBS轻洗细胞3×3min。
11、二抗：滴加足够量适宜浓度的二抗，37℃，30min（从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行）。
12、除去二抗，使用PBS轻洗细胞3×3min。
13、二氨基联苯胺（DAB）底物显色：室温下避光孵育5至10分钟，或直至样本出现棕褐色（选作，二抗连得是酶的必做，显色时间严格控制，要避免显色过度引起假阳性；二抗连的是荧光素的不用做）。
14、除去显色工作液，使用PBS冲洗细胞3~4次。
15、复染核：0.5ug/mlDAPI（或200nMHoechst33342）避光孵育5min。
16、使用PBS轻洗细胞4×5min，洗去多余的DAPI。
17、取爬片时将注射器针头针尖向背面做个小钩，将爬片轻轻勾起，用小镊子取出。
18、用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察并采集图像。
19、保存细胞爬片，在培养皿底放一层面巾纸，放爬片，便于实验取片。在盖子上做标记，在-20℃可保存2-3个月。