长二代(红三代和富二代的区别)

大家好，本篇文章为大家解答以上问题，相信很多人对长二代都不是特别的了解，因此呢，今天就来为大家分享下关于长二代以及红三代和富二代的区别的问题知识，还望可以帮助大家，解决大家的一些困惑，下面一起来看看吧！

本文目录一览

• 1、三代测序入门
• 2、美国队长二代是巴基，是不是永远都是巴基了？一代永远不会回来了吗？（我说的是电影版！！）

三代测序入门

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共有的特点：

10X Genomics，是常规Illumina二代测序的升级版，由于开发出了一套巧妙的Barcoding建库方案，使得Illumina这种短读长二代测序能够得到跨度在30-100Kb的linked reads信息，与二代测序数据相结合，在Scaffold的组装上能够得到媲美三代测序的组装结果

其GC偏好性如何？

10X Genomics技术相对于Illumina来说，有改进，但依旧是个拱形，而PacBio则是无偏倚的均一分布。10X的技术，其Coverage一样是受GC含量影响较大的，那么如果真要应用10X技术，那么必须注意目标DNA的GC含量分布最好能控制在30～70%。

真正的单分子测序（Helicos True Single Molecule Sequencing）

待测DNA 被随机打断成小片段，在每个小片段（ 200bp）的末端加上poly-dA，并于玻璃芯片上随机固定多个 poly-dT 引物，其末端皆带有荧光标记，以利于精确定位。

首先，将小片段 DNA 模板与检测芯片上的poly-dT 引物进行杂交并精确定位，然后逐一加入荧光标记的末端终止子。这个终止子与 Illumina 的终止子可不一样，不是四色的，是单色的，也就是说所有终止子都标有同一种染料。

在掺入了单个荧光标记的核苷酸后，洗涤，单色成像，之后切开荧光染料和抑制基团，洗涤，加帽，允许下一个核苷酸的掺入。通过掺入、检测和切除的反复循环，即可实时读取大量序列。最后以软件系统辅助，可分析出完整的核酸序列。

缺点 ：Heliscope 在面对同聚物时也会遇到一些困难，但可以通过二次测序提高准确度；由于在合成中可能掺有未标记的碱基，因此其最主要的错误来源是缺失。

PacBio SMRT（single molecule real time sequencing）技术也应用了边合成边测序的思想，并以SMRT 芯片为测序载体。

基本原理是：DNA 聚合酶和模板结合，4 色荧光标记4 种碱基（即是dNTP），在碱基配对阶段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。

DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一，读长主要跟酶的活性保持有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。

PacBio SMRT 技术的一个关键是怎样 将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景区别出来 ：

优缺点：

该技术的关键之一是，它们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。当DNA 碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。

测序原理：

特点：

Nanopore 测序仪 MinION 的一些特征：

ONT公司目前推出的几款测序仪：

在 ysis文件夹中，下机的数据被分割为三个文件进行存储

数据的命名:

Pacbio 数据的文库模型是两端加接头的哑铃型结构，测序时会环绕着文库进行持续的进行，由此得到的测序片段称为 polymerase reads ，即一条含接头的测序序列，其长度由反应酶的活性和上机时间决定。目前，采用最新的 P6-C4 酶，最长的读长可达到 60kb 以上。

polymerase reads 是需要进行一定的处理才能获得用于后续分析的。这个过程首先是去除低质量序列和接头序列：

处理后得到的序列称为 subreads ，根据不同文库的插入片段长度，subreads 的类型也有所不同。

对长插入片段文库的测序基本是少于2 passes的(pass即环绕测序的次数)，得到的reads也称为 Continuous Long Reads (CLR) ，这样的reads测序错误率等同于原始的测序错误率。

而对于全长转录组或全长16s测序，构建的文库插入片段较短，测序会产生多个passes，这时会对多个reads进行一致性校正，得到一个唯一的read，也称为 Circular Consensus Sequencing（CCS）Reads ，这样的reads测序准确率会有显著的提升。

不同于二代测序的碱基质量标准Q20/Q30，三代测序由于其随机分布的碱基错误率，其单碱基的准确性不能直接用于衡量数据质量。那么，怎么判断三代测序的数据好不好呢？

需要关注的是两个比例：

目前采用的组装策略：

这四种组装策略并不是完全孤立的，在一个组装任务的不同阶段会用到不同的方法

不同的组装策略可以选用的工具：

基因组的组装问题，实际上就是从序列得到的图中搜寻遍历路径的问题，有两种构建图的方法：

可以看到，随着reads长度的增加，基于OLC算法的组装工具组装出的contigs的长度几乎在线性增长，而基于de Bruijn图算法的组装效果并没有随着reads长度的增加而提高

三代单分子测序会产生较高的随机错误，平均正确率在82.1%-84.6%。这么高的错误率显然不能直接用于后续的分析，需要进行错误校正：

校正过程中会将short reads未覆盖到的Gap进行裁剪，short reads在PacBio long reads上的覆盖情况：

这样做的其中一个考虑是去除adapter

那么是什么原因导致了低覆盖度区域的产生的呢？

Base-calling做的就是从测序仪输出的电流信号波形图中将碱基解码 (decoding) 出来

第一步就是就是对波形图进行分段 (segmentation)，即检测每个current shift的边界，这一步由ONT公司提供的 MinKNOW 完成，但是分段基于的假设是ssDNA分子匀速穿过nanopores，但是由于ssDNA穿过nanopore的速度很快，很容易产生一两个碱基的速度差异，这样就容易在decoding时造成insert和delete

接着就基于current shift进行base calling，ONT公司提供的base caller为Metrichor，其底层算法基于HMM，将可能的k-tuple（由k个碱基组成的序列）作为隐藏状态，将current signals作为观测状态。ONT公司最新开发出的Metrichor用RNN取代了HMM，并将其整合到其开发出的新的生物信息数据分析平台EPI2ME中

随后，科研圈又开发出了开源的base calling工具，Nanocall 和 DeepNano。

ONT后来又在github上开源了一个RNN base-caller —— Nanonet

测序时，测序仪 MinION 连接上主机，安装在主机上的软件 MinKNOW 控制测序仪，对于每条reads，其 signal segmentation 结果（包括segment mean, variance and duration）以及测序过程中的 metadata 会被保存成FAST5格式的二进制文件（基于 HDF5标准 的变种）。

保存在FAST5文件中的原始数据会经过云端的Metrichor的处理，产生的解码的序列会被保存在另外的以 .FAST5 为后缀的HDF5文件中，包含一条template read和一条complement read或只有一条 2D read 。

MAP (MinION Access Programme) community 开发出的用于处理FAST5文件的工具，它们均能从FAST5文件中解析出FASTA/FASTQ文件，除此之外还有各自特色的质量统计功能：

参考资料：

(1) 生物技能树论坛：PacBio sequence error correction amd assemble via pacBioToCA

(2) 天津医科大学，伊现富《系统生物学-chapter2》

(3) Nanopore 第四代测序技术简介

(4) Magi A, Semeraro R, Mingrino A, et al. Nanopore sequencing data ysis: state of the art, applications and challenges.[J]. Briefings in Bioinformatics, 2017.

(5) 细节曝光！Oxford Nanopore真机还原，听听圈内人怎么说

(6) 三代测序–QC篇

(7) PacBio Training: Large Genome Assembly with PacBio Long Reads

(8) Koren S, Schatz M C, Walenz B P, et al. Hybrid error correction and de novo assembly of single-molecule sequencing reads[J]. Nature Biotechnology, 2012, 30(7):693-700.

(9) 冷泉港ppt：Hybrid De Novo Assembly of Eukaryo6c Genomes

(10) Leggett R M, Darren H, Mario C, et al. NanoOK: multi-reference alignment ysis of nanopore sequencing data, quality and error profiles[J]. Bioinformatics, 2016, 32(1):142-144.

美国队长二代是巴基，是不是永远都是巴基了？一代永远不会回来了吗？（我说的是电影版！！）

电影里目前只有一个美国队长，至于未来的话，从巴基饰演者与漫威签9部片约以及美国队长饰演者只签6部片约来看，二代美国队长是巴基，而且克里斯埃文斯如果不续约的话，要么让巴基来接替当二代美国队长，要么再找别人来演。 美国队长二代是巴基，但演员不可能演一辈子，而且好莱坞拍戏很看电影的受欢迎程度，如果巴基做美国队长不受欢迎，什么情况都可能会发生。
当然这只是根据一些情况所作的假设，你所提的问题只有等《美国队长3》了。看看漫威在电影里到底会不会提及队长之死以及英雄内战。